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2023年4月6日发(作者:怎么群发消息)
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谈到LTP不能不提到DonaldHebb以及他在1949年说
过的一段话:``Whenonecellrepeatedlyassistsin
firinganother,theaxonofthefirstcell
developssynapticknobs(orenlargesthemifthey
alreadyexist)incontact
withthesomaofthesecondcell.”
``WhenanaxonofcellAisnearenoughtoexcite
acellBandrepeatedlyor
persistentlytakespartinfiringit,somegrowth
processormetabolic
changetakesplaceinoneorbothcells,suchthat
A’sefficiencyasone
ofthecellsfiringB,isincreased.”
这段话预言了学习记忆的机制——LTP的发现。
1973年,Bliss等在海兔海马的单突触传入通路上给
与短串强直刺激后,使突触后细胞的兴奋,突触后电
位出现长达数天乃至数周的振幅增大,这种现象称之
为长时程突触增强(LTP)。从此,LTP受到了神经科
学家的广泛重视,认为是学习和记忆的基本神经基础。
1983年,科学家发现NMDA(N—甲基—D—门冬氨酸)
受体通道复合体在LTP过程中起着重要作用。
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关于LTP的诱导和形成机制,文献上研究和讨论最多
的是哺乳动物海马CA1区的LTP。有关机制可以简略
概括为:当突触前的传入纤维受到高频刺激时,兴奋
性神经递质谷氨酸从突触前膜到突触间隙,和突触后
膜上的NMDA受体结合,激活NMDA受体,使阻
碍钙离子内流的镁离子被移除,大量钙离子内流,激
活细胞内的一系列分子过程,最终形成LTP。
在以后的一段时间内,我计划从各方面分别讨论LTP
的诱发和形成机制,今天刚刚列了一个大纲(继续补
充,希望大家提建议):
1.Theimportantmolecules:
(1)钙离子
(2)NMDA
(3)aCaMKII
(4)PKA
(5)immediateearlygene
(6)CREB
(7)AMPA
(8)Retrogrademessenger
(9)其他离子通道
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(10)alpha-actin
(11)PP1
(12)PSD-95
2.海蜗牛中的LTP的研究
3.MossyfiberLTP
4.CerebellumLTP
5.其它脑区的LTP
6.抑制性神经元在LTP中的作用
7.转基因技术和基因敲除技术在LTP研究中的应用举
例
8.intrinsicexcitabilityandLTP
9.metaplasticity——LTPofLTP
TD?——timing
eticsandLTP
12.来自形态学研究的证据——Spinearchitecture
andLTP
13.尚未结束的战争:LTP——pre-syanpticor
post-synaptic?
14.……(请补充)
15.……(请补充)
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......
-2.各种LTP纪录的protocol方法集锦
-1.其他
下次我首先讨论aCaMKII在LTP的形成和学习记忆中
的作用,发表时间大概在下周末左右。在讨论完
aCaMKII后还没有想好,如果各位战友对某一个小主
题感兴趣可以提出来,可以在讨论完aCaMKII后展开
讨论(-1.其他和-2各种LTP纪录的protocol方法
集锦我从现在开始积累,不能提前)。
另外,毕竟和LTP相关的研究太广泛了,一个人的力
量有限,我一个人写完这么多方面速度可能和蜗牛相
比,有兴趣的战友我们可以共同完成这个主题,每人
分担其中的一个或几个方面的总结。
关于LTP的具体实验问题的讨论,如果有问题的战友
可以直接跟帖提出问题,我会一一回贴回答。
随着神经科学的发展,神经电生理技术作为检测细胞/
组织功能的一个实验手段,越来越受到众多学者们的
重视。考虑到做LTP相关实验的战友越来越多,为此,
我们特别邀请bluebacopa战友开一个专题讨论,
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bluebacopa在神经电生理方面有很多经验和体会,也
很愿意和大家交流,希望战友们积极参与讨论!
我们对bluebacopa表示感谢!
LTP的分子机制
1。CaMKII(1)
CaMKII这个蛋白是个很特殊的蛋白,在脑内含量非常
高,大约占总蛋白量的1-2%。在突触部位的含量很
高,并且是PSD(postsynapticdensity)主要蛋白。
但这个蛋白最特殊之处是其具有自身调节能力,仿佛
自己本身就是一个具有学习记忆的功能。
让我们看看这个蛋白的“光辉形象”。从外部看这个
蛋白的形状象两片重叠在一起的雪花,12个亚基
(subunit)形成一个双层的六角形,12个亚基排列
的非常规则。除了这个美丽动人的外表之外,这个蛋
白作为与学习记忆,与LTP密切相关的重要蛋白之一,
有着她自己独特的分子生物学特性---自身具有记忆
功能。
CaMKII有四种亚型(isoform),分别为α,β,γ,
δ,其中以α,β在脑内的含量最高。这里我只说
α亚型,也就是αCaMKII的故事。
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说到分子结构,首先要知道的就是这个分子有几个结
构域(domain)。αCaMKII的每一个亚基有四个结
构域,一个催化活性结构域,自身抑制结构域,自身
磷酸化结构域,一段Self-associationdomain(包
含一段自由可变区)。催化活性域由底物结合位点,具
有催化活性,这一结构域具有催化磷酸转移酶反应的
作用;Self-associationdomain是多个亚基互相结
合不可缺少的,我想不需要过多的讨论。但这个蛋白
的自身抑制结构域和自身磷酸化结构域非常特殊,咳,
咳,注意了,你可以忽略刚说的这一段让人感觉很枯
燥的话,但不要忽略下边一段。
刚说了,这个蛋白分子有一个催化活性结构域,但由
于有自身抑制结构域的存在,在正常的情况下催化活
性结构域并没有催化活性。自身抑制结构域的作用就
像是一把锁,在自身抑制结构域内有一段蛋白结构和
CaMKII的催化底物结构相似,这个假催化底物区占据
催化域中的底物结合位点(S-site),使酶无法和底
物结合,抑制其磷酸激酶活性。开这把锁的钥匙就是
“钙离子/钙调蛋白复合物”,当细胞受到高频刺激,
NMDA受体开放,钙离子内流,细胞内钙离子浓度增高,
就有了开锁的钥匙了。不过这把锁很怪,一旦打开了,
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就很难再锁上了,总开着。是因为和钙离子/钙调蛋白
结合以后,“锁区”---自身抑制结构域中的T-site
中的一个氨基酸位点(Thr286)被相邻的亚基磷酸化,
邻近结构发生变化,不再能够和S-site结合了。这时
即便是细胞内的钙离子已经降低了,由于相邻亚基的
互相磷酸化作用,这个CaMKII一直处于活化状态(记
忆?)。CaMKII的分子记忆功能就表现在这里:她自
己能够“记住”曾经和钙离子/钙调蛋白复合物结合
过,并且这个记忆可以保持一段时间(几分钟到一小
时,对分子来说已经很长了)。(快乐的鸽子留言:如
果觉得很枯燥,可以开始走神了,可以自动跳过下一
段)
所以,CaMKII在细胞内有3种不同程度的活化状态:
a.不包括自身磷酸化的活化状态:受到的刺激比较
弱,12个亚基中的某一个或两个不相邻的亚基和钙离
子/钙调蛋白短暂结合而活化,0.1s-0.2s后失活。
(0.1s-0.2s正好是钙调蛋白和CaMKII的解离时间
常数)
b.自身磷酸化状态:受到的比较强的刺激的时候,钙
离子升高的时间和幅度都增大,同一个全酶
(holoenzyme)结构中的至少两个亚基和两个钙离子/
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钙调蛋白复合体结合。一个钙离子/钙调蛋白复合体激
活一个亚基A,同时另一个钙离子/钙调蛋白复合体
激活相邻的亚基B并引起亚基B的变构,使Thr286
暴露出来,被亚基B被亚基A激活,然后亚基B可以
进一步激活亚基C,直到整个全酶的12个亚基都被活
化。一旦被激活后,即使是细胞内的钙离子水平已经
下降到正常水平,CaMKII还可以继续保持活化状态。
这种活性状态可以持续几分钟,直到Thr286位点去磷
酸化失活。
c.第三种状态:自身磷酸化的过程经常和去磷酸化过
程同时存在,但当细胞受到的外界刺激很强时,自身
磷酸化的速率大于去磷酸化的速率,CaMKII蛋白表现
为长时间持续活化状态。
CaMKII的这一特征是MaeyKenney
(/~mbklab/
l)的实验室在1986年发现的。在1989年,roberto
malinow
(/)和
RichardTsien
(/group/Tsienlab/)发现
抑制突触后的PKC和CaMKII抑制LTP的诱导。
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CaMKII的这些特点:脑细胞内尤其是PSD中含量高,
具有“分子记忆功能”---自身磷酸化,抑制CaMKII
后抑制LTP的诱导,都提示CaMKII在LTP的形成过程
中和学习记忆的过程中可能发挥重要作用。
正好这时,有两个科学家开始了一个将产生惊人结果
的实验。导师SusumuTonegawa由于发现了产生抗体
多样性的遗传原理,刚得到了一个诺贝尔医学奖不久
(1987年),博士后AlcinoSilva刚得到遗传学的博
士学位,两个原研究领域与学习记忆毫不相关的人决
定研究学习和记忆的分子生物学机制(现在Alcino
Silva把这个方向的研究叫做Molecularand
CellularCognition
()。两个科学狂人(一
个觉得做免疫就那样了,反正已经得了诺贝尔奖了,
再做做别的领域的研究,另一个初生牛犊不怕虎)用
了不到3年的时间,第一次把基因敲除的方法用到了
学习和记忆的研究中,敲除了脑内一个蛋白--CaMKII,
彻底抑制了LTP的诱导,同时发现动物的空间学习记
忆功能严重受损。这个结果以背靠背的两篇article
的形式发表在Science杂志上,到目前已经共被引用
了一共1000多次。
(/;
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/)(快乐的鸽子留言:看
来要想科研非常成功,首先脑子不正常,要敢想敢做,
心有多大,舞台就有多大,难呀。)
证明了CaMKII在LTP的诱导和学习记忆中的作用,从
CaMKII的特殊分子特点可以推断出,下一步就是需要
证明CaMKII的这一特殊分子特点(Thr286位点磷酸
化引起的自身磷酸化)在LTP和学习记忆中的作用了。
这时AlcinoSilva已经在冷泉港实验室建立了自己的
实验室,他的博士后已经开始着手做这方面的实验了,
后来的结果证明是,只需改变CaMKII蛋白中的的一个
氨基酸,就足以对LTP和学习记忆产生影响了。
(快乐的鸽子留言:今天就写这些了。
下次接着写Thr286的结果,顺便讨论一下基因敲除技
术。以及CaMKII的失活过程的调节位点,CaMKII对
AMPA的作用,CaMKII和NMDA受体的相互作用,以及
这些分子间的相互作用实如何影响LTP和学习记忆
的。
PS:我是利用实验之余的时间写的,同时还在准备博士
毕业写论文,没有特别认真准备,想到哪儿写到哪,
写得比较粗糙,难免有错误和遗漏之处,敬请各位战
友不吝纠正和补充,这样才能真正达到讨论交流和互
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相学习的目的。我明天还要去开一个会,下星期4才
能回来,今天仓促贴出这一段,以做到我开始时说的
每星期帖一段,下周末开会回来再把CaMKIi的第二部
分写完。
在证明了CaMKII在LTP的诱导和记忆的形成过程中是
必需的(necessary)了之后,下面一个问题就是
CaMKII的激活是不是足以诱导LTP(sufficient)。
在1994年,Malinow所领导的实验小组证明了用重
组牛痘病毒介导在海马突触后神经细胞内表达组成性
激活的CaMKII,可以引起LTP。这篇文章在证明了
CaMKII的重要性的同时,还在当时LTP到底是突触前
还是突触后机制的大论战争中为“突触后派”提供了
一个重要的证据(关于突触前和突触后的问题以后讨
论)。
在AlcinoSilva1992年发表的基因敲除CaMKII的文
章里,在敲除了CaMKII之后,还在留了一个尾巴,在
原基因组留下了用于筛选阳性克隆的neo基因。虽然
这给大家留下了一个问题:导致LTP缺失和学习记忆
受损会不会是留下的这个neo尾巴呢?由于当时已经
有很多实验表明了CaMKII在学习记忆中重要性,所以
小问题并没有影响着两篇章要文章在science上出
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现。[*基因敲除技术(参考
/bbs/post/view?bid=156&id=406
0211&sty=1&tpg=1&age=0)]
在1998年,AlcinoSilva自己领导的实验室在
Science上又发表了一篇文章,第一作者是现在
UniversityCollegeofLondon的教授Karlpeter
Giese
(/staff/personalpage
s/)。在这篇文章中,作者利用新的
基因嵌入技术,基因嵌入的方法与基因敲除基本上是
一样的,不同的是不但把整段基因都敲除除去,而是
用一段外源性的基因代替内源性的基因,CaMKII中
的自主磷酸化位点上的第286个氨基酸threonine被
一个氨基酸alanine所代替,使CaMKII不能够在这一
位点被激活,实验的结果是仅仅一个氨基酸的变化就
引起了LTP诱导不出,小鼠的学习记忆受损,这个T286
位点地自身磷酸化是LTP的诱发所必需的。
另外在1994年,2000年诺贝尔奖获得者ericKandel
实验室发表了2篇文章,利用可调节的T286D转基因
小鼠,使处于持续活化状态的CaMKII大量表达,发现
强刺激100Hz的刺激所诱导的LTP是正常的,但较低
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品率5-10Hz刺激所诱导的LTP受损,诱导LTP所需要
的域值升高,在行为学实验中转基因组的表现明显比
对照组差。这一行为结果可以拿来和下面Ype
Elgersma的文章对比来看,一个是LTP诱导的域值下
降,一个LTP诱导的域值上升(关于可调节的转基因
系统-tTA/tet-O系统,见下一贴)
CaMKII自身的磷酸化调节位点除了T286以外,还有
一个重要的调节位点,那就是位于305位和/或306
的两个threonine.这两个位点也是自身磷酸化位
点,但和T286不同,这两个位点的自身磷酸化使蛋白
的激酶活性受到抑制,所以这两个位点被称为抑制性
自身磷酸化位点。体外的实验表明,在T286被磷酸化
后,很快发生T305,306位点的抑制性磷酸化过程。在
基础水平(basallevel),这两个位点处于持续被磷
酸化的状态中。(ShenK,1999)体外实验还发现
T305,306两个位点的磷酸化使CaMKII和PSD区蛋白
的结合减弱,T305,306这两个位点上的磷酸化过程在
LTP的诱导和学习记忆中的作用在Silva实验室的另
一篇文章中被揭示。
2002年,Silva实验室的博士后YpeElgersma(:
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/fgg/neuro/research/Elgersma
/)在neuron上发表了一篇文章,在这篇文
章中,作者们做了两组系的基因潜入的小鼠,一组是
TT305/6VA系,305,306l两个位点上的两个threonine
杯不能磷酸化的两个氨基酸所代替,所以TT305/6VA
的305,306两个位点不能够被磷酸化,使CaMKII不
再具备抑制性自身磷酸化功能。第一组是T305D,
threonine被aspartate所代替,aspartate本身带负
电,干扰CaMKII和Ca/CaM结合,抑制T286位点的自
身磷酸化,其效果是和T305,306位点的磷酸化一致
的,就是使CaMKII处于失活状态。结果和预测的一致,
T305,306两个位点的磷酸化可以使PSD区的CaMKII
蛋白减少。
随后的LTP诱导实验结果很有趣:
1.先看TT305/306VA:a.在比较弱的刺激下:
100Hz/0.04s或10Hz/10s的刺激,在野生型对照组小
鼠中诱导不出LTP,但在TT305/306VA小鼠中诱导出
了LTP。b.在比较强的刺激条件下,2-thetaburst刺
激或100Hz/1s的刺激,在野生型和突变小鼠中诱发了
相同幅度的LTP。说明TT305/306VA的点突变使LTP
的诱导刺激的域值降低了。
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2.T305D更为戏剧性a.首先由于T305D这个点突
变使CaMKII一直处于失活状态,几个不同的常用诱导
条件(2-thetaburst刺激或100Hz/1s的刺激)都没
有能够诱导出LTP。这点还能够理解。B.但使人吃惊
的是完全敲除CaMKII却能够诱发出一定程度的LTP,
只是比野生型对照组的显著要小。这一点文章给出了
解释,在完全敲除alphaCaMKII的小鼠中,betaCaMKII
有明显的代偿性增加。
再来看行为学实验结果:
1.先说T305D,完全诱导不出LTP,水迷宫实验的结
果是动物根本就学不会,连续训练8天或14天的结果
还是随即的搜索4个象限。alphaCaMKII完全敲出的
突变组比对照组要差,但还有一定的学习能力,这和
LTP结果一致,可能也是因为betaCaMKII的代偿作用。
2.但是在TT305/306VA中,更容易诱发出LTP,但
水迷宫实验的结果是第8天和对照组相同,在第14
天比对照组还差。比对照组学的慢,和LTP的结果并
不一致。然后实验者把隐藏的平台又换了一个位置,
动物必须学找到新的平台位置同时忘掉原来的平台位
置,突变组的动物学的还是慢。这说明容易诱导LTP
并不一定总伴随着学习记忆能力的增强。LTP诱导容
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易的一个结果还可能是脑内产生过多的“噪音”,干
扰正常的学习记忆过程。
关于alphaCaMKII在LTP诱导中的作用暂时写道这里,
这里先主要说了CaMKII自身调节位点的磷酸化过程
在LTP诱导中的作用。另外,CaMKII本身还具有其他
多个重要的蛋白结合位点和调节位点,比如和NMDA
受体,AMPA受体的结合和相互作用等,在LTP的诱导
和表达过程中也非常重要,在以后具体写到相应的受
体时再详细讨论。
接下来我开始写NMDA受体在LTP诱导中的作用,还会
写到LTP诱导过程中CaMKII和NMDA受体的相互作用。
大概会在周末的时候发第一部分。
附:可调节的转基因系统之一:
转基因表达的“开关控制系统”---tTA/tet-O系统
和rtTA/tet-O系统.
tTA/tet-o系统用的是两组转基因表达在同一组小鼠
上,其中tTAgene在CaMKIIpromoter(根据所要表
达部位的不同可用不同的promotor)的控制之下,
使tTA基因只表达在前脑的兴奋性细胞中。另一组准
基因系统是tet-Opromoter控制之下的目的基因,
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tet-O基因可以被tTA激活,而且只有在tet-O
promoter被激活之后,目的基因才开始表达。当两组
转基因表达在同一动物上时,CaMKIIpromoter使tTA
基因只表达在前脑的兴奋性细胞中,tTA基因表达一
种蛋白(真核细胞转录启动因子)激活Tet-Opromoter,
启动目的基因的表达,这是目的基因的表达处于
“开”的状态。但给小鼠的水或饲料中添加
doxycycline一段时间后,tTA的活性受到抑制,目的
基因的表达也随之被“关闭”。这一个“开关控制系
统”有两个缺点:一是在小鼠的发育过程中,目的基
因的表达是处于“开”的状态,外源性的转基因经常
是对动物有害处的,可能影响小鼠的发育。即便是在
小鼠很小的时候就用doxycycline使目的基因处于
“关”的状态,doxycycline可以在动物的身体内沉
积,使doxycycline很难以被清理出动物体内
由于以上缺点,Kandel的实验室有开发了另一个“开
关控制系统”:rtTA/tet-O系统,其原理和tTA/tet-O
系统的原理是一致的,但这个系统使目的基因在开始
的时候是处于“关”的状态,只有在通过在水或者饲
料中添加doxycycline才能使目的基因处于“开”的
状态。
另一个可诱导的转基因表达系统是受变异的雌激素受
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体控制的,以后写到
Creb和LTP的关系时再写。
在pubmed中输入NMDA可以查出23471篇文章,输入
NMDA和LTP两个关键词可以查出1158篇文章,可见
关于NMDA的研究已经非常详细非常深入了。
LTP的是在1973年第一次被Bliss和Lomo发现的,
很快就抓住了大家的眼球,对于LTP和学习记忆的关
系,LTP的机制进行了充分的研究,现在我们都已经
知道NMDA在LTP的诱导中有着重要的作用,在某些部
位和形式的LTP诱导过程中是必不可少的。第一次认
识到NMDA受体(CollingridgeGL,KehlSJ,McLennan
H.1983)在LTP诱导中的重要作用是在LTP发现之后
10年,1983年。第一次发现LTP的文章发表在J
Physiol,第一次发现NMDA在LTP中的作用也是在J
Physiol,那时的JPhysiol比现在影响大的多。
在这个实验中,作者们选用了NMDA的特异拮抗剂APV,
发现APV在基础条件下对CA1区的fEPSP没有影响,
但可以阻断高频刺激所引起的LTP的形成。对NMDA
受体在LTP诱导中的作用提供了有利的证据。自从这
个实验以后,同样的方法又被用了无数次用以证明某
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种形式或部位的LTP是不是NMDA受体依赖性的,所以
这个实验堪称经典实验之一(一点题外话:APV的全
称是DL-2-amino-5-phosphonovalerate,在欧洲都叫
做APV,在北美叫做AP5,在中国叫做……,反正我把
这两个名字换着用,体现者中国的博大精深。在历史
上对NMDA受体的研究有重要影响的有两个:一个是
NMDA受体基因的分子克隆,另外一个就是工具药APV
的使用。第一次克隆NMDA基因是在1991年由东京的
一个实验小组得到的。)
NMDA在LTP诱导中的重要性现在已经是众所周知的。
其实NMDA这个受体很好的体现了LTP的3大特性之
一:联合性。首先看一看NMDA的分子结构,这一部分
写得比较枯燥。我分以下几点简单的写一些:a.谷氨
酸受体分类b。NMDA受体的拓扑学受体的亚
基组成;
基本上可以归结为几句话:
1。谷氨酸受体分3类,NMDA受体是其中的一种。
2。NMDA结构有细胞外的N端,3个跨膜区,一个膜内
的Loop,细胞内的C端。
3。每个NMDA有4个亚基,其中有2个必不可少的NR1
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亚基,和两个NR2A和/或NR2B亚基组成。NR2A和NR2B
亚基是近来LTP/LTD研究的又一轮热点之一。
以下是较详细的一段描述,写得很枯燥,没有耐心者
建议可以忽略,不影响对以后内容的理解。
a.谷氨酸受体:谷氨酸是中枢神经系统内最重要的兴
奋性氨基酸递质,谷氨酸受体有两种:即代谢型受体
(metabotropicglutamatereceptors,mGluRs)和
促离子型谷氨酸受体(ionotropicglutamate
receptors,iGluRs)。(小声说,其实这两个古怪的名
字是我刚刚google出来的,觉得很别扭,我还是用
mGluR和iGluR比较习惯)
谷氨酸受体的分类NMDA受体,AMPA受体,和kainate
受体是根据各自的不同的特异的受体得来的。其实从
分子生物学角度来看,分别属于至少6大基因家族
(genefamilies),谁让药理学方法远远早于基因学
分类方法呢,到目前药理学分类方式一直占有绝对统
治优势。这里只写NMDA受体:
受体的结构:
毫无疑问,NMDA受体是一个跨膜蛋白(我承认是我废
话,受体蛋白当然是跨膜蛋白了),这个跨膜蛋白的N
端在细胞外,C端在细胞内,有3个跨膜区(M1,M3,
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M4),另外还有一个M2其实是个“伪跨膜区”,夸了
半截又弯回来了,在膜内形成了一个发卡状的loop,
这个M2就是离子通道的主要组成部分。NMDA受体的
晶体结构到现在还没有结晶出来,到目前为止只有一
篇晶体结构的文章发表在这个月10日的nature上,
还是一个部分片段的结晶,其大部分结构和功能的研
究还是主要是一些靠点突变+cysteinescan方法得到
的非直接证据。
这里有一张NMDA拓扑学的示意图:
NMDA受体的晶体结构到现在还没有结晶出来,到目前
为止只有一篇晶体结构的文章发表在这个月的
nature上,还是一个部分片段的结晶,其大部分结构
和功能的研究还是主要是一些靠点突变+cysteine
scan方法得到的非直接证据。
C端区有多个被蛋白激酶磷酸化的位点,又位于细胞
内,因此是调节参与多种细胞内活动的重要区域。
N端区和M3,M4之间的loop共同构成受体结合位点,
还有一张示意图:
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C。NMDA受体家族成员由(NR1)、(NR2A、NR2B、NR2C、
NR2D)(NR3A、NR3等多种亚基构成。在到目前目前
为止关于LTP的研究中,研究最多的是NR1、NR2A、
NR2B三种亚基。其中NR2A和NR2B在LTP,LTD,以及
学习记忆中的作用更是现在研究的热点。
我把各个亚基的主要特点罗列一下:
1.每个NMDA受体中都含有两个NR1亚基,没有不含
有NR1的NMDA受体,
2.2个NR1和两个NR2亚基组成异源聚合体
(heterooligomers),可以有三种形式,NR1/NR2A,
NR1/NR2B,NR1/NR2A/NR2B。
3.NR2A,NR2B的数量是随着年龄的变化而此消彼长,
幼年动物的NR2B较多,随着年龄的增长NR2A数量逐
渐增多。
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4.而NR2C主要表达在小脑中,
5.NR2D是只在胚胎阶段表达的亚基类型。
6.含有NR2A或NR2B亚基的二聚体NMDAR具有高电导
通道开放和对胞外Mg2+高敏感的特点
7.而含有NR2C或NR2D的NMDAR则具有对细胞外Mg2+
阻断低敏感和低电导通道开放;
以上1-7是我现在能够想起来的一些特点,没有对此
进行认真的文献检索,可能会有遗漏和错误。
NMDA受体在LTP诱导中的作用
第一次认识到NMDA受体(Collingridgeetal.,1983)
在LTP的诱导中的作用。这一结果已经为所有研究
LTP的科学工作者所熟悉。
LTP有一个重要的特征是联合性(associatitivity),
NMDA受体的重要特点之一——Mg2+对NMDA受体得的
电压依赖性阻滞作用,是是学习记忆过程中联合性
(associatitivity)的重要分子基础。这一重要功能
可使NMDA受体能对不同的兴奋性突触输入进行整合,
并改变突触传递的效能。镁离子的这一作用是在1984
年(Nowaketal.,1984),被发现的。
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在镁离子浓度为零的情况下(实线),谷氨酸引起的
NMDA电流变化是几乎完全和电压成正相关的,I/V
曲线几乎呈现一条直线,但在细胞外液中有镁离子存
在的情况下(虚线),在膜电位为负值时,NMDA通道
的通透性很小;相反在膜电位为正值时,I/V曲线几
乎没有受影响。可见细胞外的镁离子在膜电位为负值
时对NMDA受体离子通道具有阻碍作用,只有当膜电位
去极化,达到正值时,谷氨酸引起NMDA开放,钙离子
内流。所以NMDA受体的开放需要两个因素同时存在:
a,和谷氨酸结合b.细胞去极化,移除镁离子的阻碍
作用。
在发现了NMDA受体在LTP诱导过程中的重要作用之
后,在1986年,Morris刚刚发明了MorrisWaterMaze
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(1984年发表的),还很“veryproudofit”呢,
NMDA受体又是一个如此重要的分子,他就用他的伟大
发明来检测了一下NMDA受体在学习记忆过程中的作
用,作出了第一篇提供NMDA对学习记忆的重要性的直
接证据的文章(Morrisetal.,1986)。
NMDA受体基因在1991年第一次被克隆出来以后
(Moriyoshietal.,1991),NMDA受体在LTP的诱导
过程和学习记忆中的作用的研究很快就进入了分子生
物学水平。因为NMDA受体不但在学习记忆中有很重要
的作用,在其他很多重要的生理病理过程都很重要,
比如说神经系统缺血保护,呼吸节律的产生。基因敲
除技术那时还是处于它的黄金时期,敲除一个基因就
意味着一篇science或者nature文章。所以很快就
有人动手做NR1的基因敲除了。敲除NR1的文章在
1994年就产生了,发表在neuron上,可见是这个基
因刚一克隆出来就开始做基因敲除小鼠了,但是在基
因敲除小鼠出生后几个小时就死了(Forrestetal.,
1994)。这篇文章说明了两个问题:1。NR1亚基在NMDA
的组成中是必须的亚基。2。NMDA对新生小鼠的成活
和发育是必须的。虽然NR1基因敲除的杂合体小鼠可
以成活到成年,但由于有发育问题的影响或者由于其
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他原因,没有人用这只杂合体基因敲除小鼠并没有用
来进行学习记忆或LTP的研究。另一个实验室在几乎
相同的时候在进行着NR2A的基因敲除工作,他们发现
敲除了NR2A之后,LTP的表达和动物的学习记忆能力
均受到了影响((Sakimuraetal.,1995)。
但是用基因敲除NR1亚基对LTP和学习记忆的研究并
没有停下来,这时基因敲除产生了很大的一个进步,
1996年,第二代基因敲除技术,条件性基因敲除技术
(conditionalknockout)问世,第一作者是著名的
华裔科学家JoeTsien.当时他在SusumuTonegawa
的实验室做博士后。如前所说,SusumuTonegawa实
验室也是第一个用基因敲除小鼠证明CaMKII在学习
记忆中的重要性的实验室,那两篇文章的的第一作者
AlcinoSilva凭两篇现在已经分别被引用了700多次
的Science文章在冷泉港建立了自己的实验室。这次
JoeTsien又在他们的导师的指导下制造了一轮能量
巨大的冲击破,在1996年的cell上发表了2篇被引
用了几百次的文章(Tsienetal.,1996a;Tsienet
al.,1996b)。SusumuTonegawa的诺贝尔奖是因为他
曾经在免疫学领域的贡献得到的,他在学习记忆领域
的贡献绝对还有资格再得一次。
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conditionalknockout的技术其实就是传统的基因敲
除技术和转基因技术的结合。用的也是Cre—loxP重
组系统,floxedgene表达在一只小鼠的所有细胞中,
Cre在特异的promotor的作用下表达在另一只小鼠的
某些细胞中,在这两只小鼠交配产生后代中,在某些
后代中(多少由孟德尔遗传规律决定)就有在某种细
胞中即有floxedgene的表达,又有cre的表达,Cre
分子就把这个细胞里的目的基因切除去了。CNSNEURON
的帖子讲得更清楚详细,有兴趣的战友可以参阅:
在JoeChen的文章中,floxedgene是NR1,转基因
小鼠的Cre是在alphaCaMKII的promotor控制下表达
的,CaMKIIalpha是表达在前脑的所有的兴奋性神经
元内蛋白,但传统的转基因技术是转基因片段并不是
完全遵照promotor的指令表达的,有时候有些偏差。
Tsien等很幸运得到了一个小鼠品系,Cre只表达在海
马的Ca1区的锥体神经元内。由于另外的一个小鼠品
系的NR1基因是被floxed的,所以得到的条件性基因
敲除小鼠是在CA1区的兴奋性神经元内NR1基因被敲
除了,所以被称为”subregion-and
cell-type-specificknockouttechnique“还因为
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alphaCaMKII是一个postnatal表达的蛋白,所以在
alphaCaMKIIpromotor的控制下的转基因也是在出生
后3-4个星期后才出现的,因此小鼠的发育没有受到
影响。
CA1区锥体神经元特异的NR1基因敲除导致了CA1区
的NMDA电流完全消失,短时程增强(STP),LTP,LTD
消失,但光学显微镜和电子显微镜的研究都没有发现
形态学的变化。这个NR1条件性基因敲除小数还有
Morriswatermaze实验中的学习记忆受损,表明了
CA1区的NMDA受体在某种形式的学习记忆中是必需
的。(说点题外话:这个故事后来又有发展,Tsien的
这篇文章上的Cre是在小鼠2个月左右取材观察Cre
的表达的,当时Cre的确只在CA1区,但其实这个小
鼠的Cre的表达范围是随年龄逐渐扩大的,在5个月
后就已经表达在整个海马包括CA1,CA3,DG区了,甚
至大脑皮层的表达也很多。这里我说的是Tsien制的
这一个系的小鼠,后来有其他实验室用和他一样的方
式制造的同样的小鼠品系并不是都有这个问题,我们
实验室现在有3个alphaCaMKII-Cre系,这3个系的
表达相互之间都略有差异。这其实是传统转基因技术
的一个缺陷,就是外来基因是随机插入的,有时表达
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范围和设想并不完全一致,所以后来华人科学家
WilliamXiangdongYang在Heintz实验室作博士后
期间首先使用了BAC转基因技术,使外来转基因的表
达定位更准确,对BAC技术有兴趣的可以参考(Yang
XW,ModelP,HeintzN.:Homologousrecombination
basedmodificationinEscherichiacoliand
germlinetransmissionintransgenicmiceofa
technol.
1997Sep;15(9):859-65.)
前一次写的NMDA亚基的分类已经说了,NR2D是只表
达在胚胎期的一个亚基,在小鼠出生的第二周其在海
马区的表达量就几乎是0了,这个亚基并且几乎没有
对镁离子的依赖性,通道开放的时间也比其他型的亚
基长。于是产生了一个有趣的转基因小鼠,这个系的
转基因小鼠,在CaMKIIpromotor的控制下,NR2D在
前脑,包括大脑皮层和海马区大量表达,导致本来表
达量虽年龄增加的NR2B的表达比对照组明显减少
(Okabeetal.,1998)。电生理实验的结果非常有意
思,这个非镁离子依赖性的通道开放时间长的亚基的
表达,在juvenile时期的小鼠海马脑片中能记录到正
常的LTP,但LTD受损。但在成年期和青少年期,LTP
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减小但LTD是正常的。但这些小鼠在Morriswater
maze的表现和对照组的差异不大,这个实验结果非常
有趣,又是LTP和学习记忆的变化方向不一致的一个
例子。
总结各个亚基的特点,NR2A和NR2B具有很强的镁离
子依赖性,比NR2C,NR2D更能体现LTP的联合性,只
有同时发生突触前和突触后的变化,才能使NMDA受体
开放引起LTP,而且刚好在大脑皮层和海马部位特异
表达的是NR2A和NR2B(大自然的设计是如此精确,
空间时间的玩美结合)而但NR2A和NR2B的表达和分
子特点还有不同之处,NR2B和NR2A随着动物年龄的
变化此消彼长,小鼠从幼年到成年的过程中海马区的
突触地可塑性是逐渐降低的,是不是由于NR2B的表达
下降导致的?可不可以人为增加NR2B的表达量,是海
马区的突触可塑性增高,小鼠变得更聪明呢?Tsien
在1996年的12月发表了前述的两篇Cell文章后,
1997年在普林斯顿建立了自己的实验室,在1999年9
月就在nature上发表了自己实验室的第一篇文章,一
只聪明的转基因小鼠诞生了,LTP的比对照组高,LTD
的变化不明显,空间学习记忆能力增强,这是通过基
因改造来提高动物学习记忆能力第一次尝试(Tanget
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al.,1999)。
Enrichment应该是可以促进LTP的产生的,至少是不
会抑制LTP的诱导的。关于enrichment促进学习记忆
的分子机制现在还不是很清楚,我想可能和一些神经
生长因子的产生和释放有关,也可能和GABA能神经递
质传递的改变有关(是我想,不知道别人是不是也这
样想)。实际上,enrichment对不仅对NMDA受体缺失
产生的学习记忆下降有关,还可以reverse其他一些
别的原因引起的学习记忆功能受损。
Cuedfearconditioning和contextfear
conditioning的区别在于CS的不同,在最常用的fear
conditioning的实验设计中,US一般的是电击,在
contextfearconditioning过程中CS是动物所处的
空间环境,因为海马对空间学习记忆很重要,所以这
个过程中一般有海马的参与。
CS在Cuedfearconditioning中一般用声或光,一
般的实验步骤有两种,一种是让动物在某一空间环境
呆很长时间后再进行条件反射训练,因为动物已经知
道了环境是无害的,形成的条件反射是不包括空间环
境的。另一种训练方法是在环境A训练,在环境B测
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试,环境A和B尽可能的不一样(包括气味,光线,
声音和布置),条件发射时只是声音或光线引起的。这
种条件发射回路是不需要海马参与的。
Cuedfearconditioning和contextfear
conditioning都需要amygdala的参与,因为amygdala
对“害怕”这种情绪反应很重要。
delay和tracefearconditioning的区别在于CS
和US的时间关系上,tracefearconditioning的实
验设计中,US和CS之间有一个较长的时间差,要解
决这种时间上非连续性的学习任务海马的参与是必要
的;delayfearconditioning的CS和US之间没有
时间延迟,delayfearconditioning对海马的损毁
不太敏感。因为在traceanddealyfear
conditioning的实验设计中,要严格控制CS的turn
on/turnoff的时间,只能用cuedfearconditioning
做,因为context是无法迅速“开关”的,不象声音
或者光,可以随时打开和关闭。一般的cuedfear
conditioning如果没有特殊说明指的是delayfear
conditioning。
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关于中文怎么说,希望其他人能帮你回答,我一点概
念都不知道,就是我写的东西有些中文名词还是我自
己编的,有很多不标准的东西几乎是肯定的。这些东
西我没有学过中文的,也几乎没有怎么看过中文的文
献,知之甚少,现在用中文写东西到处找中文说法比
看文献的时间可能还长,找不到就用英文或者现场制
造一个,请原谅。还有原文的问题,一般的杂志学校
图书馆都有电子版,在哪里都可以通过学校的服务器
下载,不用担心上传原文的问题。
LTP和LTD的诱导都需要有NMDA受体的活化,这个结
论很自然的产生的一个问题就是:同一个受体参加两
种不同的生理过程,这个受体也就是NMDA受体参与
LTP和LTD的诱导过程有什么不同呢?
NMDA受体这个“一身两用”的作用产生的原因其实
是其活化程度的结果,也可以说是细胞内钙离子升高
程度不同的结果。RobertMalenka(Cummingsetal.,
1996)的实验室在1996年发表一篇neuron文章,发现
在LTP诱导过程中,加入较低浓度的APV,部分阻断
NMDA受体,使tetanicstimulation后的胞内钙浓度
轻度上升,本来可以诱导出LTP的刺激只得到了LTD。
同理,通过将突触后膜钳制在一个叫静息电位更负的
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超极化水平,使突触后电位在tetanicstimulation
后轻微上升,细胞内的钙离子轻度升高,原本可以诱
导出LTP的刺激也诱发了LTD。由此可见,受到tetanic
stimulation后细胞内的钙离子浓度升高程度是决定
突触可塑性方向的一个关键因素。而NMDA受体的这个
“一身两用”的作用也正是通过其自身的通透性调节
胞内钙浓度实现的。2000年(Nishiyamaetal.,
2000),Kato的实验室发表了一篇nature文章证实
了这一理论并且进一步发现了LTP/LTD之间转换的另
一个“轴”—细胞内的钙库的作用。LTD诱发过程需
要细胞内的ryanodinereceptorsandinositol
triphosphate(InsP3)receptors的参与。阻断细
胞内的ryanodinereceptorsandinositol
triphosphate(InsP3)receptors使本来应该产生
LTD的刺激条件诱导出了LTP。(对胞内钙离子浓度的
影响还有VDCC的作用)
NMDA受体由NR1,NR2等亚基组成,其中NR1亚基是
必须的,没有NR1就没有NMDAR,在成年动物的海马,
占主要地位的NR2是NR2A和NR2B.但两个重要的NR2
亚基NR2A和NR2B的表达在动物出生后的表达是变化
的,幼年动物的NR2B较多,随着年龄的增长NR2A逐
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渐增多。(华裔科学家MogenSheng和YuhNungJan
在这方面发了很多文章)同时突触可塑性也在发生变
化,在幼年动物脑片诱发LTP容易,诱发LTD也容易。
在成年鼠的海马脑片上,很难诱发出LTD。那么NR2B
和NR2A在LTP/LTD的诱发过程中的作用是否不同呢?
难道是NR2B和NR2A表达水平的变化导致了LTP/LTD
的诱发难易程度的变化?要证明NR2B和NR2A在
LTP/LTD的诱发过程中的作用,YuTianWang和他实验
室的科学家们所用的方法非常直接:分别只阻断NR2B
或者只阻断NR2A,然后分别观察LTP/LTD的诱发情况
(Liuetal.,2004)。
他们这个实验的结果也很直接:
1.用ifenprodil或Ro25-6981阻断NR2B,LTD
的诱发被阻断,但LTP的产生并未受到影响。
2A的特异性阻断剂NVP-AAM077(0.4uM)可
以阻断LTP的产生,但对LTD的产生没有明显作用。
3.同样,在全细胞记录的LTP,LTD实验中,得到
了相同的结果:阻断NR2B阻断了LTD的诱导但对LTP
的诱导没有影响。
相反,阻断NR2A对LTD的诱导没有影响,但是在NR2A
拮抗剂存在的条件下,本来可以诱发出LTP的刺激条
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件导致了LTD的产生。
综上所述,从这些实验可以得到这样的结论:NR2A是
诱导LTP所必需的而NR2B是诱导LTD所必需的。
他们的发现可以用来解释海马神经元的可塑性随动物
年龄的变化而产生的变化:随着年龄的增加,NR2A增
加NR2B减少,LTD的诱导变得越来越难。基因敲除NR2A
使LTP和学习记忆受损(Sakimuraetal.,1995)。
但和以前的某些大的发现似乎有不相符之处:如果
NR2B是LTD诱导所必需的而对LTP的诱导没有明显影
响,过量的表达NR2B应该导致LTP没有变化,LTD的
诱导更加容易。但YangpingTang和JoeTsien的1999
年的结果显然不是这样的(Tangetal.,1999),过量
的表达外源性NR2B导致了LTP的表达高于对照组但
LTD没有明显区别,而且动物学习能力增强。Butwhy?
这篇文章反映了nature和science杂志在选择发表
的文章的时候的一个重要原则之一,发在这两个杂志
上的文章都很“sexy”,热点,一下子就可以抓住大
家的眼球,但文章本身并不都是完美无缺的,这篇文
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章就给大家留下了很大的继续探索的余地。
很快,有几篇文章提出了不同的看法:
1.LackofNMDAReceptorSubtypeSelectivityfor
ci.
25:6907-6910
ich,kal,,,
g,,(2005).
2.ActivationofNR2A-ContainingNMDAReceptors
IsNotObligatoryforNMDAReceptor-Dependent
Long-TermPotentiation.
uf,,on,a,
er,(2005).
ci.25:8386-8390
3.NMDAreceptorsubunitcompositioncontrols
synapticplasticitybyregulatingbindingto
CaMKII.
BarriaA,MalinowR
Neuron.2005Oct20;48(2):289-301.
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但也有支持的:
,n,,Y.P.
Auberson,,,G.L.
,Differentialroles
ofNR2AandNR2B-containingNMDAreceptorsin
corticallong-termpotentiationandlong-term
depression,ci.24(2004),pp.
7821–7828.(在perirhinalcortex部位)
.
5.RolesofNMDANR2Bsubtypereceptorin
prefrontallong-termpotentiationandcontextual
fearmemory.
ZhaoMG,ToyodaH,LeeYS,WuLJ,KoSW,ZhangXH,
JiaY,ShumF,XuH,LiBM,KaangBK,ZhuoM.
Neuron.2005Sep15;47:859-72.(海马依赖性的
行为学结果支持)
6.Neuron.2005Jun2;46(5):745-60.
DifferentialrolesofNR2A-andNR2B-containing
NMDAreceptorsinRas-ERKsignalingandAMPA
receptortrafficking.
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KimMJ,DunahAW,WangYT,ShengM.
对这些结果就不一一详细列举了,不过总的看来,争
论部分主要集中在LTP的诱导机制方面,在LTD方面
的争论还是相对小些。导致这些不一致结果的原因可
能包括阻断剂的特异性(这点很明显,ci.25:
6907-6910),动物的年龄,品系不同,诱导LTP,LTD
方式的不同,记录部位的不同等原因。关于NR2A和
NR2B在突触可塑性中作用的研究还远没有搞清楚,相
信很快就有更多的这方面文章出现。
这个周末我再找时间写一写关于NMDA受体和CaMKII
的相互之间的作用。在LTP的诱导过程中,参与的分
子和蛋白很多,这些分子或蛋白之间也互相作用,形
成仿佛一张大网。关于这些分子间的相互作用,这些
分子到底是怎样互相依赖,互相激活,相互抑制,精
确的调节突触地可塑性,还远远不够清晰。因为这一
段时间写了一些CaMKII和NMDAR在LTP诱导中的作
用,我希望能把这两个重要蛋白间的相互作用关系顺
便写一些。
AMPA
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从今天开始介绍在LTP的诱导表达过程中的另一格非
常重要的蛋白:AMPA受体。LTP的诱导需要NMDA受体
的激活,钙离子内流,PKC,MAPK,CaMKII等激酶的
活化,那么在LTP的诱导过程中,这些细胞内的化学
变化是如何最终表达为突触传递的增强呢?AMPA受
体就是参与LTP的表达过程的重要蛋白之一。
大家都知道,对于LTP的研究研究过程到现在还在继
续,到目前为止,对于LTP的诱导和表达过程已知的
是NMDA受体激活,钙离子内流,CaMKII活化,但其
下游的具体过程并不是很清楚,大致已经知道了由很
多重要分子的参与,基因转录功能启动,蛋白质的表
达增加,但具体细节例如各分子间如何相互作用相互
协调的过程并不清楚。但LTP的结果是清楚的:突触
传递增强。
导致突触传递增强的原因不外乎3种:突触前释放增
加,突触后受体数量或功能的变化,突触间隙的递质
清除减慢。但到底是哪一种机制在起作用呢?
在海马区的LTP研究中,最初试图给这一问题找到直
接答案和证据的实验利用了递质的量子化释放的原理
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(quantalmodelfortransmitterrelease)。这一
原理最初是通过对神经肌肉接头处的递质释放研究发
现的。在对LTP的研究中,通过观察LTP对quantal
model中的不同参数(q:单个量子释放引起的突触后
变化;m突触前释放的量子数量)的影响,确定突触
前或突触后的变化。在早期,通过运用量子释放理论
对LTP的研究,不但没有搞清当时突触前或突触后的
争论,反倒带来了更多的迷惑(关于突触前或突触后
机制的争论以后才写,这里先重点讨论AMPA)。直到
后来,第一次对中枢神经系统的量子化释放理论进行
了修改,在q,m,之外还有一个重要的参数n,即突触
的数量的改变。这就是现在要说的silencesynapse
的理论基础。
silencesynapse首先是从理论上推断出来的:
那么silencesynapse的理论是怎样提出的呢?
nn(Kullmann,1994)可是太聪明
了,通过总结前人的两方面的工作提出了这一理论:
1.由于诱导LTP后的量子化释放的变异系数
(coefficientofvariation,CV)是变化的,说明
突触前的量子式的释放增加,所以LTP的表达是突触
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前的变化引起的。(MalinowandTsien,1990)
2.在LTP诱导之后,NMDAR介导的兴奋性突触后电
位(EPSC)并没有发生变化,如果说LTP的释放是突触
前机制引起的递质释放增加引起的,NMDA受体和AMPA
受体的神经递质是一样的,都是L-谷氨酸,突触前的
谷氨酸释放在引起AMPA受体介导的EPSC的变化的同
时,NMDA受体介导的EPSC同样也会发生变化。但是
真实的情况是:在LTP诱发后,只有AMPA-EPSC变化,
NMDA-EPSC没有变化,所以说LTP的表达是突触后的。
(MullerandLynch,1988)
3.上述两种说法好像都对,当时两家各执一词,争
论得不可开交,几乎每月的nature,science上都有
新的论据的提出。在上述两个理论打成一团的时候,
nn基于前人的实验结果,稍稍把
实验改进了一小步,提出了一个新的理论:silence
synapse的理论。
他将AMPA-EPSC,NMDA-EPSC分开来分析,同时观察了
AMPAR和MNMDAR的EPSC在LTP诱导前后的变化:假
设所有的表达NMDA受体的突触都同时表达AMPAR,因
为他们合用同一种神经递质,那么两者的变异系数CV
应该是相等的。然而,实际的结果却是:AMPAR-EPSC
的CV比NMDAR-EPSC高。在诱发LTP后,NMDAR的CV
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是不变的,只有AMPA-EPSC发生变化。
对上述现象的解释就是:有些有NMDAR受体表达的突
触上没有AMPAR表达,LTPinduction"uncovers
clustersoflatentAMPA/kainatereceptors,with
nochangeintransmitterrelease",这就是
silencesynapse模型的提出,而后的很多电生理和
解剖学的研究都支持了这一模型。
为silencesynapse理论提供实验证据:
nn首先从理论上提出了silent
synapse的存在,后来Malinow和Malenka的实验室
分别证实了silentsynapse的存在,最直接的证据则
是用实验证实通过分析synapticfailures发现的
(Montgomeryetal.,2001)。
silentsynapse是怎样的一种突触呢?大多数的情况
下NMDAR和AMPAR是共存于突触后膜上的,但也有一
些突触的后膜上只有NMDA受体,没有AMPA受体的存
在。这方面最直接的证据首先是用电生理的方法分析
synapticfailures发现的:
先看看什么是synapticfailures。Synaptic
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failures分两种:releasefailures和transmission
failures
1.当动作电位到达突触前部位时,有些突触部位的
神经递质不能释放到突触间隙,称为release
failures,releasefailures是经常存在的。事实上
动作电位到达突触前膜的时候,多个突触部位同时受
到刺激,而从突触后的变化是由EPSCsandfailures
混合而成的。
2.如果递质释放到突触间隙不能引起突触后的反
应,称为transmissionfailures。
A.由于NMDA受体的性质决定,在静息电位时NMDA
受体被镁离子阻挡,这是谷氨酸释放不能引起NMDA
受体的反应,引起transmissionfailures。
B.如果通过钳制电压是突触后去极化,镁离子的阻碍
作用被以移除,NMDA受体引起的transmission
failures就不存在了。
C.综合A,B可以得出,在静息电位的情况下的
synapticfailures多于去极化膜电位时的synaptic
failures。而且通过NMDA的这一特性可以区分开NMDA
受体和AMPA受体介导的反应。
3.通过比较LTP诱发前和诱发后的Synaptic
failures可以发现,只有AMPA介导的突触反应的
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Synapticfailures减少了,而NMDA受体介导的
Synapticfailures没有变化。说明了在诱发LTP后,
有一些本来没有表达AMPA受体的突触有了有功能的
AMPA受体的表达。
现在silencesynapse的理论,现在已经是LTP界普
遍接受的一个模型了。
(题外话:如果想了解LTP的电生理方面的工作,看
RogerNicoll,RobertoMalinow,GaryLynch,Robert
Malenka等几个大牛的文章可能就够了。)
silencesynapse理论也得到了形态学方面的证据,
用免疫金标电镜的方法,比较LTP诱导前后突触部位
的NMDAR/AMPAR的表达情况,可以发现AMPAR的表达
的变化,和silencesynapse的理论是一致的,再次
证明了这一理论的正确性。
silencesynapse的理论提出了这样一个模型:在LTP
表达过程中,更多AMPA受体通过某种机制表达到突触
部位,导致在突触前释放谷氨酸受体量不变的情况下,
突触后反应增加。那么,AMPAR是怎样表达到突触后
膜上的呢?这里有涉及到了一个新的理论:AMPAR
trafficking
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AMPA受体如何到达突触后膜部位
关于AMPAR如何到达了突触后膜,有两种可能:一是
原本存在于突触外部位的AMPAR通过平行滑动到达了
突触部位,另一种可能是细胞内的AMPAR通过出胞作
用表达到了突触部位的细胞膜上。现在的证据多支持
后者:
1。在LTP的诱发过程中有膜融合的过程(Lledoetal.,
1998)。A.阻止了膜融合过程可以阻止LTP产生。B.
促进膜融合过程可以增强突触部位的递质传递,C.但
诱发了LTP后此传递过程减弱,说明LTP诱发过程中
存在着膜融合的过程,也就是出胞作用是存在的。
2。另一个证据就是在CA1神经元内表达GluR1-GFP
的融合蛋白(Shietal.,1999),静息状态下融合蛋
白大部分散在分布于细胞浆内,在高频刺激后可以看
到这个绿色蛋白的聚集和向着突触所在部位——树突
棘(dendriticspine)部位的聚集。而且这一过程也
是NMDA受体依赖性的,可以被AP5所阻断。这一结果
说明了AMPA的亚基在高频刺激后的聚集成AMPAR的过
程。但是,这些AMPAR怎样表达到了突触后膜上呢?
3。只包括GluR1亚基的AMPA受体是完全的内向整合
通道(inwardrectification),而包括了GluR2的
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AMPAR离子通道没有整合作用的。通过过量表达
GluR1-GFP就可能导致细胞内的GluR1大大多于GluR2,
诱发LTP的高频刺激一些只含有GluR1亚基表达到突
触后膜,如果这种只表达GluR1的AMPA受体增加必将
导致内向整流作用增大,这是可以通过电生理的方法
就检测的。果真,在静息电位下这些外源性的蛋白都
表达在细胞内,和对照组比内向整流作用没有明显区
别,但高频刺激后内向整流作用明显变大。说明这些
亚基在高频刺激后不但可以聚集,还可以融合到突触
后膜,使EPSC增大(Hayashietal.,2000)。
以上2,3是有很多是Song-HaiShi博士毕业论文的
部分内容,Song-HaiShi因此获得了Science
magazineandAmershamBiosciences发的Young
ScientistPrize。毕业后Song-HaiShi博士又在
UCSF的著名华人科学家LilyJanandYuhNungJan
夫妇的实验室从事博士后工作,明年3月份Song-Hai
Shi博士将在Sloan-KetteringInstitute建立自己
的实验室,只要研究方向是神经发育方面的。(我的感
觉是中国人在美国做神经发育的比较成功的80%来自
于LilyJanandYuhNungJan实验室)
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说了半天AMPAtrafficking和silencesynapse的问
题,到底在学习记忆过程中有没有这个过程呢?目前
关于silencesynapse在学习记忆中的起作用,虽然
结论很可能是肯定的,但还没有直接证据。但AMPA
trafficking今年有了直接证据,
这部分还没有写完,下面这篇文章是今年发表的:
RumpelS,LeDouxJ,ZadorA,MalinowR.
Science.2005Apr1;308(5718):83-8.
Postsynapticreceptortraffickingunderlyinga
formofassociativelearning.
这篇文章是来自于同一科研小组,作者们看到了在学
习的过程中,AMPAtrafficking的发生,用GluR1C
末端的片断作为dominantnegative的抑制剂,可以
发现阻断AMPAtrafficking可以阻断学习记忆。这篇
文章我想做为第一次JournalClub的讨论主题,到时
再详细讨论。
以下是关于silencesynapse和AMPAtrafficking
的研究中的部分文献:
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Hayashi,Y.,Shi,S.H.,Esteban,J.A.,Piccini,
A.,Poncer,J.C.,andMalinow,R.(2000).Driving
AMPAreceptorsintosynapsesbyLTPandCaMKII:
requirementforGluR1andPDZdomaininteraction.
Science287,2262-2267.
Kullmann,D.M.(1994).Amplitudefluctuationsof.
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Lledo,P.M.,Zhang,X.,Sudhof,T.C.,Malenka,
R.C.,andNicoll,R.A.(1998).Postsynaptic
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Mack,V.,Burnashev,N.,Kaiser,K.M.,Rozov,A.,
Jensen,V.,Hvalby,O.,Seeburg,P.H.,Sakmann,
B.,andSprengel,R.(2001).Conditional
restorationofhippocampalsynapticpotentiation
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Malinow,R.,andTsien,R.W.(1990).Presynaptic
enhancementshownbywhole-cellrecordingsof
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long-termpotentiationinhippocampalslices.
NATURE346,177.
Montgomery,J.M.,Pavlidis,P.,andMadison,D.
V.(2001).Pairrecordingsrevealall-silent
synapticconnectionsandthepostsynaptic
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Muller,D.,andLynch,G.(1988).Long-term
potentiationdifferentiallyaffectstwo
componentsofsynapticresponsesinhippocampus.
ProceedingsOfTheNationalAcademyOfSciences
OfTheUnitedStatesOfAmerica85,9346.
Shi,S.H.,Hayashi,Y.,Petralia,R.S.,Zaman,
S.H.,Wenthold,R.J.,Svoboda,K.,andMalinow,
R.(1999).Rapidspinedeliveryand
redistributionofAMPAreceptorsaftersynaptic
e284,
1811-1816.
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由于能力,时间和精力有限,只能写一写主要的发现,
其间肯定遗漏了一些其他重要文章,占有如发现请补
充。
缺血过程中除了NMDAR和钙离子的参与,还有其他重
要分子的参与。在学习记忆过程中,同样除了这两个
分子还有其他分子的参与,现在已知的和学习记忆有
关的分子有200多种。除了NMDA受体激活和钙离子增
加这个相同过程外,缺学和学习记忆都分别有其他分
子的参与,决定细胞活动的方向。这些“其他分子”
现在可能还没有完全搞清楚,但现在已经知道了其中
的一些。我不是这方面的专家,缺血研究的最新进展
我知道的不是非常清楚。神经所今年发了一篇文章探
讨这方面的问题的,你可以找来看一看。
Gao,J.,Duan,B.,Wang,D.,Deng,X.,Zhang,G.,
Xu,L.,andXu,T.(2005)CouplingbetweenNMDA
ReceptorandAcid-SensingIonChannel
48:
635-646.
另外,我想即便是NMDA受体激活钙离子内这两个细胞
内分子变化在缺血反应和学习记忆这两个过程中还有
个“度”的问题,钙离子增加的程度不同导致的结果
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也会不同。但就学习记忆过程来说,LTD和LTP这两
个看似相反的过程都需要NMDA受体激活和钙离子浓
度增加,但一个引起LTP,突触传递增强,另一个引
起LTD,突触传递减弱。关键就是LTD诱发过程中钙
离子浓度的较小幅度的增加,而在LTP诱发过程中,
钙离子增加的幅度较大。可能缺血过程中钙离子增加
的幅度更大,超过了生理范围(我猜的,没有找文献
依据),触发细胞凋亡过程。细胞都死了当然就不能增
加学习记忆了。
而且在学习记忆过程中,还有一个细胞内分子活性的
基础水平的问题。比如说学习记忆过程中有CaMKII
活性的增加,但不表示CaMKII活性一直处于高水平就
有利于学习记忆。
在小鼠前脑内表达一直处于活性状态的CaMKII使学
习记忆下降,你可以参考:
BachME,HawkinsRD,OsmanM,KandelER,Mayford
mentofspatialbutnotcontextualmemory
inCaMKIImutantmicewithaselectivelossof
hippocampalLTPintherangeofthetheta
.1995Jun16;81:905-15.
(还有这个实验组的几篇类似文章,你可以查出来看
看)
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另一个实验组作的另外一个knock-in小鼠,使CamKII
激活后不容易失活,相应也是脑内CaMKII活性增加,
结果也是LTP的诱发域值增加,学习记忆下降。
ElgersmaY,FedorovNB,IkonenS,ChoiES,
ElgersmaM,CarvalhoOM,GieseKP,SilvaAJ.
InhibitoryautophosphorylationofCaMKII
controlsPSDassociation,plasticity,and
.2002Oct24;36(3):493-505.
所以说,虽然LTP,学习记忆的过程有某一分子的活性
增加说水平上升,但并不等于说这种分子越多越有利
于学习记忆,维持正常的基础水平也很重要,否则“噪
音”太大了,神经元就不能更有效的过滤出有效信号
了。
AMPA受体是一个多聚体,由4个亚基组成。组成AMPA
受体的亚基包括GluR1-GluR4.在成年的哺乳动物的
海马区,AMPAR的组成主要有两种:GluR1-GluR2以
及GluR2-GluR3.不同亚基的位于细胞内的C末端的
长短各异,在海马区,GluR1,GluR4和部分GluR2
(GluR2L)的C末端都是长片断。
AMPAR的不同亚基的C末端可以和细胞内的其他蛋白
或因子起作用,这些和AMPAR相互作用的蛋白都含有
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一个或几个PDZ结构域。这些蛋白可以分成两大组:1,
和GluR1结合的;2,和GluR2及GluR3结合和。
和GluR1结合的蛋白有SAP97和RIL;和GluR2/GluR3
结合的蛋白有GRIP,ABP/GRIP2,rGDLG6和afadin
等蛋白。
AMPA受体在LTP的产生过程中,silentsynapse和
AMPA受体trafficking一直受到极大的关注,是LTP
诱导和产生的分子机制的热点之一。但同时还有一方
面的研究不可忽视,就是AMPAR分子本身的变化。
来自OregonHealthSciencesUniversity的Thomas
ing实验室的AndresBarria当时还在读博
士期间在science上发表了一篇文章,第一次提供了
在LTP的诱导过程中的AMPAR自身的变化的直接证据。
(AndresBarria现在在Malinow实验室做博士后,
今年在neuron上发表了一篇文章,是关于LTP诱导过
程中NR2B亚基和CaMKII的相互作用,估计现在在job
market上找工作,不出意外明年就可以建立自己的实
验室了)
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在AndresBarria这篇文章中,作者们做了一系列非
常直观的实验(Barriaetal.,1997b):首先是检验
LTP诱导后CaMKII的磷酸化。这一实验的结果和前人
的结果是一致的,LTP诱导后CaMKII在T286位点发
生自体磷酸化。
然后又检测了LTP诱导后AMPAR的磷酸化。这是首次
发现LTP诱导后有AMPAR磷酸化发生,AMPAR受体在
LTP诱导后的磷酸化发生在GluR1,GluR2和GluR3并
没有发生磷酸化。
接下来的实验是这篇文章的点睛之笔:在当时已知
NMDA受体钙离子和CaMKII参与了LTP的诱导过程。
这篇文章的作者们分别用APV和KN-62阻断NMDAR和
CaKII,发现APV可以阻断CaMKII的磷酸化,说明了
CaMKII仔LTP的诱导过程中处于NMDAR的下游。KN-62
可以阻断AMPAR的磷酸化,说明AMPAR处于NMDAR的
下游。
这篇文章提供了LTP的诱导过程中的各个分子相互调
节的关系:高频刺激—?----NMDA受体激活
---?-----CaMKII磷酸化-----?-----AMPAR受体磷
酸化----?----LTP。后来的很多实验都是在这个模式
的基础上进行的。
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在这篇science文章发表的同一年,AndresBarria
还发表了另外一篇JBC文章,证明了AMPA受体上的
CaMKII磷酸化位点是GluR1的Ser831(Barriaetal.,
1997a)。这篇文章采用的是传统的细胞生物学方法:
首先用GST融合蛋白找出AMPA受体上被CaMKII磷酸
化的位点位于C末端,然后用点突变的方法确定这个
作用位点是S831,这一位点是PKC作用位点,提示
CaMKII可能通过某种途径激活PKC,然后引起GluR1
在S831位点的磷酸化。GluR1上还有一个S845位点
是PKA的作用位点,在这个实验中,CaMKII激活后并
不能直接引起GluR1的S845这一位点的磷酸化。
这篇JBC是一个体外实验,实在HEK293表达系统中得
出的结论。在同一时间的另外一篇JBC文章,也得出
了和AndresBarria等人同样的结论(Mammenetal.,
1997)。自然而然的,下一个问题就是:在高频刺激
LTP的诱导过程中也是在GluR1的S831位点发生磷酸
化反应吗?到目前为止,大家公认的答案是yes!这一
结论是通过对AMPAR的电导变化的观察得出的结论。
gridge实验室发表在Nature上发
表了一篇文章(Benkeetal.,1998)。在这篇文章中,
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作者们发现在高频刺激诱发LTP后AMPA受体的电导增
加。另一篇文章发现CaMKII的活化也可以通过磷酸化
GluR1的S831导致AMPAR的电导增加(Ponceretal.,
2002),所以可以得粗结论:LTP或激活CaMKII所引
起的AMPAR电导增加的原因很可能是由于GluR1亚基
在S831位点的磷酸化,这个结论基本也得到了研究
LTP分子机制的科学界的公认。
由此可见,在LTP的诱导和表达过程中,NMDAR激活,
Ca离子增加,CaMKII激活后最终导致AMPAR发生两方
面的变化:1。AMPAR的膜转运导致AMPAR在突触后膜
的insertion增加。2。AMPAR的GluR1亚基在S831
位点磷酸化,AMPAR电导增加。这两种变化都导致突
触传递的增强,导致LTP的产生。
这个结论同时产生另外一个问题,AMPAR受体的膜转
运和在S831位点的磷酸化,电导增加这两方面是互相
调节的前后两个步骤还是两个相互平行的过程?
从目前的观点看来,答案倾向于后者,即这一过程是相
互平行的过程。
支持这一结论的只要有两方面的试验:
1.GluR1上S831位点的点突变使这一位点不能
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被磷酸化(当然也就不能增加AMPAR的电导了),
CaMKII活化依旧可以使AMPAR表达到突触后膜上,
AMPARtrafficking并不受影响(Hayashietal.,
2000)。
2.但GluR1上的S831位点不变,只有S845位点
的点突变后,AMPAR的trafficking受影响,高频刺
激后不再有AMPAR在突触后膜的表达增加。说明S845
位点的磷酸化是必须”necessary”的。(但不是充
分”sufficient”的)
S831是GluR1亚基中的PKC的作用位点,而S845是
PKA的作用位点,LTP产生的过程中AMPAR的这两个
主要变化是神经元内不同的信息传导通路同时被激活
的作用能够结果。
LTP产生过程中AMPARTraffickingandinsertion
还受到其他很多种蛋白分子活性的调节,如SuyGap,
Sap97,Ras等分子,以后写到相应分子的作用时再详
细讨论。
缺血过程中除了NMDAR和钙离子的参与,还有其他重
要分子的参与。在学习记忆过程中,同样除了这两个
分子还有其他分子的参与,现在已知的和学习记忆有
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关的分子有200多种。除了NMDA受体激活和钙离子增
加这个相同过程外,缺学和学习记忆都分别有其他分
子的参与,决定细胞活动的方向。这些“其他分子”
现在可能还没有完全搞清楚,但现在已经知道了其中
的一些。我不是这方面的专家,缺血研究的最新进展
我知道的不是非常清楚。神经所今年发了一篇文章探
讨这方面的问题的,你可以找来看一看。
Gao,J.,Duan,B.,Wang,D.,Deng,X.,Zhang,G.,
Xu,L.,andXu,T.(2005)CouplingbetweenNMDA
ReceptorandAcid-SensingIonChannel
48:
635-646.
另外,我想即便是NMDA受体激活钙离子内这两个细胞
内分子变化在缺血反应和学习记忆这两个过程中还有
个“度”的问题,钙离子增加的程度不同导致的结果
也会不同。但就学习记忆过程来说,LTD和LTP这两
个看似相反的过程都需要NMDA受体激活和钙离子浓
度增加,但一个引起LTP,突触传递增强,另一个引
起LTD,突触传递减弱。关键就是LTD诱发过程中钙
离子浓度的较小幅度的增加,而在LTP诱发过程中,
钙离子增加的幅度较大。可能缺血过程中钙离子增加
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的幅度更大,超过了生理范围(我猜的,没有找文献
依据),触发细胞凋亡过程。细胞都死了当然就不能增
加学习记忆了。
而且在学习记忆过程中,还有一个细胞内分子活性的
基础水平的问题。比如说学习记忆过程中有CaMKII
活性的增加,但不表示CaMKII活性一直处于高水平就
有利于学习记忆。
在小鼠前脑内表达一直处于活性状态的CaMKII使学
习记忆下降,你可以参考:
BachME,HawkinsRD,OsmanM,KandelER,Mayford
mentofspatialbutnotcontextualmemory
inCaMKIImutantmicewithaselectivelossof
hippocampalLTPintherangeofthetheta
.1995Jun16;81:905-15.
(还有这个实验组的几篇类似文章,你可以查出来看
看)
另一个实验组作的另外一个knock-in小鼠,使CamKII
激活后不容易失活,相应也是脑内CaMKII活性增加,
结果也是LTP的诱发域值增加,学习记忆下降。
ElgersmaY,FedorovNB,IkonenS,ChoiES,
ElgersmaM,CarvalhoOM,GieseKP,SilvaAJ.
InhibitoryautophosphorylationofCaMKII
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了。
LTP,今年你读这些文章了吗?
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D.,Naumann,M.,Kunesch,E.,Benecke,R.,
Reiners,K.,andClassen,J.(2005).
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